AI蛋白质设计+连续进化：刘如谦团队Nature论文提出蛋白酶工程新范式

哈佛大学刘如谦（David R. Liu）团队在 Nature 发表最新研究，提出一种将 AI 蛋白质设计与实验室连续进化相结合的蛋白酶工程新范式。研究先用 AI 模型 ProteinMPNN 对天然蛋白酶做序列重设计，获得稳定性更高且保持催化活性的变体，再以此为起点进行噬菌体辅助连续进化（PACE），最终获得针对非天然靶点的高稳定性、高催化效率和高特异性的蛋白酶。

从天然酶到 AI 设计起点

传统定向进化通常以天然酶为起点，但天然酶稳定性有限，改造后常出现表达下降、活性不足或特异性丧失等问题。研究团队认为，蛋白酶的「进化潜力」与其初始稳定性密切相关，因此先用计算方法提升起点蛋白酶的稳定性，再将其送入 PACE 进行功能进化。

计算设计：稳定化 BoNT/E 蛋白酶

以肉毒神经毒素 BoNT/E 为模型，研究团队用 ProteinMPNN 保留底物识别与催化的关键残基、对其余位点重新生成序列，并用 AlphaFold2 评估结构。实验结果显示，多数 AI 设计变体仍能切割天然底物 SNAP25，其中 D1、D2、D3 三个变体综合表现最佳，D3 的最高催化效率达到野生酶的 2.8 倍。

为验证这一方法是否依赖特定模型，他们还用 PROSS 重新设计 BoNT/E，同样获得了表达、稳定性和酶动力学改善的变体。该流程也被拓展到 BoNT/F 和 BoNT/X，结果保留或提高了催化效率。

PACE 进化：新底物切割能力

获得稳定化变体后，研究团队比较了 D3 与天然酶在三个新底物（415、413、412）上的 PACE 进化表现：

• AI 设计变体在三个新底物上都获得了更高活性；
• 在最难底物 412 上，天然酶四组实验中只有两组得到有效变体，而 D3 四组全部成功；
• D3 变体的 PACE 回路激活达到 16–20 倍，约为天然酶变体（约 10 倍）的两倍。

突变互换实验进一步表明，部分有益突变仅在 AI 设计背景下有效，不能直接移植到天然酶中，说明 AI 设计的稳定化蛋白酶可探索不同于天然酶的序列空间。

修复稳定性损失与拓展治疗靶点

针对此前研究中 PTEN 切割变体 E(4130)A2 存在的低表达、低稳定性问题，研究团队把进化突变移植到 D1、D2、D3 中：

• 新变体保留了 PTEN 切割能力，且不再切割天然底物 SNAP25；
• 在大肠杆菌中表达量提高 2.2–5.2 倍；
• 在 HEK293T 细胞中，D2、D3 表达量提高超过 24 倍，PTEN 切割产物分别增加 4.5 倍和 3.9 倍。

在 ataxin-2（与神经退行性疾病相关的蛋白）靶向上，AI 设计起点产生的 D3 进化变体切割速度提高 1.4–1.7 倍，且不切割天然底物 SNAP25，细胞中表达更高、副产物更少。

局限与展望

研究团队也指出，目前工作主要围绕 BoNT/E 展开，该方法能否推广到其他蛋白仍需更多验证；ataxin-2 靶向蛋白酶仍处于工具酶和早期应用阶段；安全性——尤其是脱靶效应、细胞毒性、递送与免疫原性——仍是未来临床应用的关键问题。

总体而言，这种「先设计稳定性、再进化功能」的工作流为蛋白酶治疗和更广泛的蛋白质工程提供了一种可推广的新范式，有望加速新酶、新型治疗蛋白及其他功能蛋白的开发。